中国兽医发布_动物源性食品中细菌的检测——分枝杆菌属

由曲志娜 赵思俊等发表于2021-07-03 12:05:23

分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌在自然界中分布广泛,包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌和副结核分枝杆菌等。其中,结核分枝杆菌与牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)被归类为结核分枝杆菌复合物(M.tuberculosis complex),是引起人和牛等动物结核病的主要病原菌。结核病是一种慢性消耗性疾病,其病理特点是在多种组织器官形成肉芽肿和干酪样、钙化结节病变。有资料表明,牛结核病中有7%是结核分枝杆菌感染,而结核病人中106%为牛分枝杆菌感染。世界上结核病人中约有15%是通过饮用了结核病牛的乳而患病的,因此乳和乳制品中结核分枝杆菌的检验尤为重要。

1 病原学特征

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌是分枝杆菌属的主要动物致病菌,也是可以引起人的结核病的病原菌。该菌为细长、直或微弯的杆菌,大小为(0.2~0.5)μm×(1.5~4.0)μm,单在、少数成丛。牛分枝杆菌菌体短而粗。与一般革兰氏阳性菌不同,该菌的细胞壁不仅有肽聚糖,还有特殊的糖脂。糖脂的影响致使革兰氏染色不易着色,而抗酸染色为红色。

该菌为专性需氧菌,对营养要求严格,最适pH为6.4~7.0,最适温度为37~37.5℃,生长缓慢,特别是初代培养,一般需10~30d才能看到菌落。菌落粗糙、隆起、不透明、边缘不整齐,呈颗粒、结节或花菜状,乳白色或米黄色。结核分枝杆菌不发酵糖类,可合成烟酸和还原硝酸盐,牛分枝杆菌无此特性。分枝杆菌对外界环境抵抗力很强,在干燥的环境中可存活6~8个月。

2 流行病学特征

患病的人和动物是主要传染源。结核分枝杆菌随鼻液、痰液、粪便和乳汁等排出体外,污染饲料、饮水、空气等周围环境,使其在人畜之间相互传播。人结核病可以传染给牛,成年牛多因与病人、病牛直接接触而感染。分枝杆菌主要通过呼吸道侵入易感机体,消化道或皮肤损伤时也可以侵入易感机体,引起多种组织器官的结核病。人和多种动物都可以感染该病,在家畜中,牛最易感染结核病,特别是奶牛,其次是水牛、黄牛。其中人通过呼吸道感染肺结核为最多,人结核病的存在严重制约着牛结核病的彻底消灭。牛结核病又能传染给人,人们饮用未经消毒或消毒不完全的患病牛的乳就可能被传染,引起人结核病的流行,所以牛结核病的存在严重威胁着人类的健康。而人畜结核病的交叉传播则造成了分枝杆菌的广泛流行。

该病一年四季都可以发生,没有季节性。

3 危害

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌可感染人和多种动物导致结核病,是一种慢性消耗性人畜共患病。

人感染分枝杆菌的主要表现为呼吸道疾病的症状,如咳嗽、咳痰等,后逐步伴有胸痛、胸闷、咯血等症状,当体内结核分枝杆菌数量较大时才会出现全身症状,如乏力、低热、面部潮红、厌食、消瘦等,还会出现关节疼痛等。

牛感染分枝杆菌的主要表现为进行性消瘦、咳嗽、慢性乳腺炎、顽固性腹泻、体表淋巴结慢性肿胀等,结核病给畜牧业尤其是乳业造成巨大的经济损失。牛结核病被我国列为牛病中的二类动物疫病。

4 分枝杆菌的检验方法

4.1 涂片检查

在分枝杆菌的微生物检验中,涂片法抗酸染色后镜检是最直接的方法。

用无菌注射器直接吸取鲜乳5~10mL置离心管中,生鲜牛乳样品在混匀器上中混匀后(或者无菌取乳粉样品5g放入灭菌烧杯中,加50mL生理盐水,剧烈振荡混匀),经4000r/min离心40min,弃上清液,加入0.5mL灭菌生理盐水重悬沉淀,涂片,齐尔-尼尔森(Ziehl-Neelsen)染色法抗酸染色后镜检,如发现红色成丛杆菌,可做出初步诊断。其他细菌和细胞呈蓝色。报告方式见表2-10。 

4.2 分离培养

为了排除分枝杆菌以外的微生物,将上述离心沉淀物用5mL灭菌生理盐水重悬沉淀,取1份悬液加2份草酸或5%氢氧化钠混合,室温放置5~10min,上清液小心倒入装有小玻璃珠带螺旋帽的小瓶或小管内,37℃放置15min,3000~4000g离心10min,弃去上清液,用无菌生理盐水洗涤沉淀,再次离心。取少许沉淀物接种在培养基斜面上,每份病料接4~6管,管口封严,置37℃培养,每2~3d观察一次,2周以后每周观察一次,至8周后无菌落生长即可报告为阴性。常用的培养基有罗杰二氏(Lowenstein-Jensen)培养基(内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐及孔雀绿等)、改良罗杰二氏培养基、丙酮酸培养基和小川培养基。培养阳性时,需进行培养特性和生化特性鉴定。

分枝杆菌在添加特殊营养物质的培养基上才能生长,但生长缓慢,特别是初代培养,一般需10~30d才能看到菌落。菌落粗糙、隆起、不透明、边缘不整齐,呈颗粒、结节或花菜状,乳白色或米黄色。在液体培养基中,菌体因含类脂而具疏水性,形成浮于液面有皱褶的菌膜。

结核分枝杆菌可合成烟酸和还原硝酸盐,牛分枝杆菌无此特性;结核分枝杆菌和牛分枝杆菌触酶试验阳性,但耐热触酶试验阴性;而禽分枝杆菌两种试验均为阳性。各型分枝杆菌均不发酵糖类。

4.3 动物接种

以30mL鲜乳样品离心(3000r/min)15min,然后先收集上层乳脂,再收集数毫升底部的乳样及其沉渣混合物。取这些混合物3mL,按照300~350g/只的剂量,鼠蹊部皮下注射健康豚鼠2只。再取上层乳脂,用少许无菌水稀释,按照上述同样剂量,鼠蹊部皮下注射豚鼠2只。3~4周后,如果注入的材料中含结核分枝杆菌数量较多,可见接种部位附近淋巴结肿大,试验豚鼠采食量减少,体重减轻,不久死亡;如果注入的菌数不多,则症状常不显著,如果8周以上仍未死亡,将豚鼠杀死剖检。为及早得到结果,也可以在注射3~4周后,对试验豚鼠进行结核菌素试验。先将豚鼠腹部的毛剃掉,然后皮内接种结核菌素0.1mL。阳性者在24~28h后在接种部位出现红肿硬块,表明已经感染,可进行剖检。

剖检可见在接种部位附近的淋巴结肿大,淋巴结内部充满干酪样物,脾、肝等处常有无数微小的结核病变,取淋巴结内的干酪样物或者病变部位的结节抹片染色镜检,可有结核分枝杆菌检出。

4.4 变态反应

采用结核菌素试验(国际贸易指定试验)。结核菌素试验是测定牛结核病的标准方法,即皮内注射牛结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD),并在3d后测量注射部位肿胀的程度。一般在颈的中部进行,但在特殊情况下,可在尾根处进行。对于结核菌素,颈部皮肤要比尾根处更敏感。

结核菌素效力必须用生物学方法测定,将这种方法与标准结核菌素比较作为依据,并用国际单位(IU)来表示。在许多国家,牛结核菌素保证每头牛剂量达2000IU(±25%),方可被认为效力可靠。对于过敏性较差的牛,需要用高剂量的牛结核菌素,在扑灭牛结核病运动中,则推荐使用剂量为5000IU,每次注射量不超过0.2mL。

皮内注射对比试验,注射的结核菌素量不应少于2000IU。两次注射的位置间隔为12~15cm。

幼龄动物颈部一侧没有足够的地方分开注射,故在颈部不同侧面注射,而且注射均在颈中1/3相对应的部位。

结核菌素试验的操作程序:

(1)注射技术必须正确,注射部位必须剪毛和消毒。剪毛区的皮皱厚度用卡尺测量。用一短针头且斜边向外装有结核菌素的刻度注射器,倾斜插入皮内深处,然后注入结核菌素。注射正确的话,在注射部位可摸到像豌豆大小的肿胀。注射后72h,测量每一个注射部位皮皱的厚度。注射前和试验结果测量应由同一个人完成。

(2)结果解释判定 单项皮内注射试验(只注射牛结核菌素),如果只观察到局限性肿胀,增厚不超过2mm,而且没有临床症状,例如扩散或延展性水肿、渗出、坏死、该区内淋巴管或淋巴结的疼痛或发炎,就可认定反应为阴性。如果有上述临床症状,或者皮皱厚度增加超过2mm而小于4mm,可认为反应为阳性。此外,在牛分枝杆菌感染群中,有任何明显的、可见的肿胀都认为是阳性。有时需要更加严格的判定,尤其在高度危险群或接触的动物。对单项皮内注射试验未得出结果的动物,应在间隔42d后另外进行试验。第二次试验结果不是阴性的动物应视为阳性。皮内注射试验阳性的动物可做皮内注射对照试验。

(3)皮内注射比较试验结果判定 如果牛结核菌素反应阳性,且皮皱厚度比禽结核菌素反应大4mm以上,则认为是阳性反应;如果牛反应是阳性,并且牛反应的皮皱厚度仅比禽反应大1~4mm,则认为该反应不能定论。如果牛反应是阳性或阴性,但其反应等于或小于禽反应,认为该反应为阴性。这一判断方法在欧盟国家广泛使用。

(4)在尾槽测试中,标准的解释是任何摸到或可见的变化都被认为是阳性反应。另一种更改的方法也常常使用,这就是注射部位尾皱处的厚度与对照相比相差4mm以上,出现可摸到或可见的肿胀时判为阳性。另外,测试动物只要有一个尾皱的厚度达到8mm或8mm以上,则认为试验阳性。

4.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乳中结核分枝杆菌抗体

牛乳中抗体检测已经用于布鲁氏菌病和白血病的诊断。有学者试图通过检测牛乳中结核分枝杆菌抗体,诊断牛患有结核病,同时评价牛乳的卫生安全。用牛分枝杆菌PPD作为包被抗原,脱脂乳(鲜牛乳4℃过夜,除去上层脂肪)为被检材料,兔抗牛IgG抗体为二抗,建立乳中牛分枝杆菌抗体的检测方法,但是由于和副结核分枝杆菌存在一定的交叉反应,只能用于牛乳中结核分枝杆菌污染的初步筛选。对于阳性样品还需要用其他方法验证。

4.6 荧光PCR法检测乳和乳制品中的结核分枝杆菌

(1)原理 乳及乳制品中结核分枝杆菌荧光PCR法是采用经典的TaqMan探针技术。根据牛分枝和人分枝杆菌的保守序列设计一对特异性引物及一条特异性荧光双标记探针,探针的5′端和3′端分别用FAM和TAMRA荧光素酶标记。当PCR反应退火时引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上报告荧光基团FAM发出的荧光信号被淬灭荧光基团TAMRA所吸收,仪器检测不到荧光基团FAM发出的荧光信号;当PCR反应进行延伸时,TaqDNA聚合酶在引物的引导下,以四种核苷酸为底物,根据碱基配对的原则,沿着模板链合成新链,当进行到探针结合部位时,受到探针的阻碍而无法继续,此时的Taq DNA聚合酶发挥它的5′→3′外切核酸酶的功能,将探针切成单核苷酸以便继续完成延伸过程,而FAM基团和TAMRA基团均游离在溶液中,仪器可检测到FAM基团发出的荧光信号。

(2)仪器与器材 荧光PCR检测仪、高速台式冷冻离心机、普通台式离心机、冰箱、涡旋振荡器、微量移液器、10mL离心管、15mL离心管等。

(3)检测引物和探针 上游引物:5′-GGTCGACACATAGGTGAGGTCT-3′。下游引物:5′-CGCTGATCCGGCCAC-3′。探针:FAM-CCGAAGCGGCGCTGGACGAG-TEMRA。扩增片段长度103bp。

(4)操作步骤

样品采集:用无菌注射器直接吸取鲜乳样品5~10mL置离心管中备用或者无菌采取25g乳粉放入无菌袋中备用。样品采集后4℃保存不超过24h,若长期保存需-20℃,且不能反复冻融。

鲜乳样品在混匀器中混匀后(或者无菌取乳粉样品5g放入灭菌烧杯中,加50mL生理盐水,剧烈振荡混匀),经4000r/min离心40min,弃上清液,加入5mL灭菌生理盐水重悬沉淀,定性滤纸过滤,滤液经4000r/min离心40min,弃上清液,加入500μL灭菌生理盐水重悬沉淀。

DNA提取:在样品中加入1.5mL4%的氢氧化钠溶液,37℃恒温处理30min或常温下处理1h,使其充分液化,若液化不完全,可适当再加入少量4%的氢氧化钠。将液化后的样品及阴性对照和阳性对照各500μL分别加入1.5mL无菌离心管中,1300r/min离心10min。弃上清液,用微量移液器尽量吸干液滴,沉淀中加入1mL灭菌生理盐水,振荡悬浮,1300r/min离心10min。弃上清液,加入1mL灭菌生理盐水,1300r/min离心10min。弃上清液,用0.5mL灭菌生理盐水重新悬浮沉淀,加12.5μL 20mg/mL的蛋白酶K和50μL的10%的SDS,55℃水浴30min。分别用Tris饱和酚、等体积酚和三氯甲烷各抽提一次。吸取上层水相,加1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃沉淀2h,4℃1300r/min离心10min。弃上清液,加入75%的乙醇,4℃1300r/min离心10min。弃上清液,晾干,加20μL TE缓冲液溶解,直接用于检测或-20℃保存备用。

样品的检测:PCR扩增反应体系25μL:10×PCR buffer(不含Mg2+)25μL,MgSO0.5μL,dNTP2.0μL,上游引物0.5μL,下游引物0.5μL,探针1.0μL,ddH2O 7.5μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,DNA模板10μL,所有成分加入荧光PCR管后,盖紧盖子,500r/min离心30s。荧光PCR检测仪循环程序:94℃,1min;95℃,5s,60℃,30s,40个循环。

单通道荧光PCR检测仪,无须选择检测通道;多通道荧光PCR检测仪,荧光信号收集时设定为FAM荧光素,60℃收集荧光信号。

以上内容来自

《动物源性食品安全危害及检测技术》是一本实用的专业技术参考书,可为国内广大动物源性食品安全检测领域技术人员提供参考资料。全书共包括七部分内容,第一部分介绍了动物源性食品安全的基本概念、危害因素以及检测技术概况;第二部分至第七部分分别针对动物源性食品中主要危害因素,如细菌、寄生虫、霉菌毒素药残留、农药残留、污染物等,对其相关检测技术进行了详细介绍,并列举了多种检测方法应用实例,具有很强的实用性和指导性,对一线检验检测人员的工作具有很好的指导作用。


扫码购书


天猫旗舰店

中国农业出版社

微信公众号

中国农业出版社

★ ★ ★



往期 · 回顾

动物源性食品中细菌的检测——副溶血性弧菌

动物源性食品中细菌的检测——志贺氏菌

名企直聘 | 职等你来

【梦想的舞台】易者同心,共筑未来!青岛易邦2021年技术类岗位招聘啦!


中国兽医发布由农业农村部畜牧兽医局主管,中国动物卫生与流行病学中心主办,《中国动物检疫》编辑部承办。欢迎您积极投稿、建言献策,投稿邮箱:zgsyfb@cahec.cn,联系电话:0532-85623545。

点开二维码图片

关注中国兽医发布

点开二维码图片

关注中国动物检疫

作者:曲志娜 赵思俊等

公众号:中国兽医发布

原文链接:http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAxNzMyNzU0Mw==&mid=2650428639&idx=8&sn=8506a19ffca692ab56bf86e8724ea01b&chksm=83e9c007b49e4911cf6cf2681b8cddbd3ef06a598cc0e70534378bd03d4dbea00132acd54fef&scene=0&xtrack=1#rd

发布时间:2021-07-03 12:05:23

发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注

Scroll to Top